Che cos’è
l’HPLC?
La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC, High-Performance Liquid Chromatography) è un metodo analitico moderno che consente la separazione, l’identificazione e la quantificazione precise dei singoli componenti di una miscela liquida. È una delle tecniche più importanti della chimica analitica ed è utilizzata ovunque sia necessario analizzare sostanze non volatili, termolabili o complesse, ad esempio nei settori alimentare, cosmetico, farmaceutico o ambientale.
A differenza dei metodi di separazione basati su gas, l’HPLC utilizza una fase mobile liquida che viene pompata attraverso una colonna di separazione ad alta pressione. All’interno della colonna, le molecole del campione interagiscono con la fase stazionaria, determinando una separazione temporale dei singoli analiti. Il risultato è un cromatogramma che mostra sia l’identità sia la quantità dei composti presenti.
Vantaggi dell’HPLC
L’HPLC presenta diverse caratteristiche che la rendono indispensabile nella chimica analitica moderna.
- Versatilità: analisi di sostanze non volatili e termicamente instabili che non possono essere analizzate, o lo possono solo con difficoltà, mediante cromatografia gassosa
- Elevata efficienza di separazione: separazione precisa anche di composti strutturalmente simili
- Rapidità: i tempi di analisi sono spesso dell’ordine di pochi minuti
- Sensibilità: possibilità di rilevare in modo affidabile concentrazioni molto basse
- Flessibilità: la scelta di colonne, eluente e fasi consente di adattare il metodo a quasi qualsiasi esigenza analitica
- Combinabilità: l’HPLC può essere facilmente accoppiata ad altre tecniche analitiche, come la spettrometria di massa (HPLC-MS), consentendo un’inequivocabile determinazione strutturale e limiti di rilevazione molto bassi
Come funziona l’HPLC
Nell’HPLC il campione attraversa una serie di fasi ben definite, che devono essere coordinate con precisione per ottenere risultati riproducibili e significativi.
Per prima cosa, il campione viene preparato. A seconda della matrice, ciò può includere filtrazione, diluizione o concentrazione. Le impurità che potrebbero danneggiare la colonna o alterare l’analisi vengono rimosse.
Il campione preparato viene quindi introdotto nel flusso continuo della fase mobile (eluente) mediante un iniettore. L’eluente viene spinto attraverso la fase stazionaria all’interno della colonna da una o più pompe ad alta pressione, generalmente compresa tra 50 e 400 bar.
La fase stazionaria è legata a un supporto solido (ad esempio gel di silice). In funzione della composizione e della chimica superficiale di questa fase, si instaurano interazioni specifiche con gli analiti, basate ad esempio su polarità, dimensioni o struttura chimica. Le sostanze che interagiscono più fortemente con la fase stazionaria avanzano più lentamente nella colonna, mentre quelle con minore affinità vengono trasportate più rapidamente.
Questi differenti tempi di ritenzione fanno sì che le sostanze emergano dalla colonna in momenti diversi. Un rivelatore registra l’arrivo di ciascuna sostanza e lo converte in un segnale elettrico, visualizzato come un picco nel cromatogramma.
Componenti di un sistema HPLC
Un sistema HPLC è modulare e può essere adattato alle proprietà delle miscele da analizzare.
Pompa: garantisce il flusso continuo della fase mobile attraverso la colonna e deve fornire una pressione costante per assicurare tempi di ritenzione riproducibili
Iniettore: introduce nel sistema un volume di campione precisamente definito senza interrompere il flusso
Colonna: riempita con un materiale fine e poroso la cui superficie è rivestita dalla fase stazionaria. La scelta della colonna (lunghezza, diametro interno, dimensione delle particelle e tipo di fase stazionaria) è cruciale per la qualità della separazione
Rivelatore: rileva gli analiti all’uscita della colonna. I rivelatori UV/VIS sono i più comuni, ma si utilizzano anche rivelatori a fluorescenza, indice di rifrazione o spettrometria di massa
Unità di elaborazione dati: visualizza i segnali del rivelatore sotto forma di cromatogramma; la valutazione avviene mediante software
Le fasi nell’HPLC e le loro differenze
La cromatografia liquida ad alte prestazioni separa le miscele in base alle diverse interazioni degli analiti con due fasi: la fase mobile (eluente) e la fase stazionaria (materiale all’interno della colonna).
L’intensità dell’interazione tra una molecola e la fase stazionaria determina in larga misura il suo tempo di ritenzione, ossia il tempo necessario per attraversare la colonna. La selezione accurata e l’ottimizzazione di queste fasi sono fondamentali per la qualità e la significatività dell’analisi.
La fase mobile: l’eluente
La fase mobile è un liquido che trasporta il campione disciolto attraverso la colonna. Solitamente è costituita da acqua e solventi organici come metanolo, acetonitrile o isopropanolo. La scelta dei componenti e del loro rapporto di miscelazione è adattata alle proprietà chimiche delle sostanze da separare.
Fattori influenzanti principali:
- Polarità dell’eluente: determina la forza di interazione delle molecole polari o apolari con la fase stazionaria
- pH: particolarmente importante per i composti ionizzabili, poiché influisce sullo stato di carica e quindi sulle interazioni
- Additivi: tamponi, sali o modificatori possono migliorare la separazione, ottimizzare la forma dei picchi o stabilizzare uno specifico stato di ionizzazione
Nell’eluizione isocratica, la composizione dell’eluente rimane costante per tutta l’analisi. È adatta a separazioni relativamente semplici con tempi di ritenzione simili.
Nell’eluizione a gradiente, la composizione dell’eluente varia durante l’analisi, ad esempio aumentando la percentuale di solvente organico. Ciò consente di eluire più rapidamente analiti fortemente trattenuti e di separare in modo più efficiente miscele complesse.
La fase mobile deve essere di elevata purezza (grado HPLC) per evitare segnali interferenti nel cromatogramma.
La fase stazionaria: all’interno della colonna
La fase stazionaria è il materiale responsabile della separazione ed è contenuta all’interno della colonna. È generalmente costituita da particelle fini di silice con dimensione definita (tipicamente 3–5 µm, in UHPLC anche < 2 µm). La superficie è modificata chimicamente per consentire interazioni specifiche con gli analiti.
Principali tipi di fasi stazionarie in HPLC:
- Fase normale: silice rivestita polare; separa le molecole in base alla polarità. Gli analiti polari sono trattenuti più a lungo
- Fase inversa: rivestimento apolare (ad es. C18, C8 o gruppi fenilici). La fase mobile è polare e le sostanze apolari restano più a lungo nella colonna. È la modalità oggi più utilizzata
- Cromatografia a scambio ionico: la superficie presenta gruppi carichi che interagiscono con analiti di carica opposta
- Cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC): separazione in base alle dimensioni molecolari. Le molecole grandi attraversano la colonna più rapidamente, quelle piccole penetrano nei pori e vengono ritardate
Influenza di lunghezza, diametro e dimensione delle particelle
I parametri fisici della colonna che influenzano le prestazioni di separazione includono:
- Lunghezza della colonna: colonne più lunghe migliorano la risoluzione ma aumentano il tempo di analisi
- Diametro interno (ID): diametri più piccoli producono picchi più stretti, ma richiedono un controllo più preciso del flusso
- Dimensione delle particelle: particelle più piccole aumentano la superficie e migliorano la separazione, ma generano una contropressione più elevata
- Dimensione dei pori: particolarmente rilevante per la separazione di molecole di grandi dimensioni come le proteine
Interazione tra fase mobile e fase stazionaria
Il principio centrale dell’HPLC è la cromatografia di ripartizione. Gli analiti si distribuiscono in equilibrio tra fase mobile e fase stazionaria. Quanto più forte è l’interazione di una molecola con la fase stazionaria (ad esempio per idrofobicità, polarità, interazioni ioniche o forze di Van der Waals), tanto più a lungo essa rimane nella colonna.
Una separazione ottimale si ottiene quando fase mobile e fase stazionaria sono calibrate in modo da massimizzare le differenze di interazione tra le singole sostanze. Parametri come flusso, temperatura e composizione dell’eluente devono essere regolati con precisione.
Rivelatori nell’HPLC
I rivelatori sono essenziali per rendere visibili le sostanze separate.
Il rivelatore UV/VIS misura l’assorbimento della luce a specifiche lunghezze d’onda ed è adatto a molte molecole organiche. Il rivelatore a fluorescenza offre una sensibilità ancora maggiore per le sostanze fluorescenti, mentre il rivelatore a indice di rifrazione (RI) consente di rilevare composti che non assorbono nella regione UV.
Per la massima specificità, l’HPLC è spesso accoppiata a uno spettrometro di massa. La combinazione HPLC-MS consente l’identificazione univoca e l’elucidazione strutturale di composti sconosciuti, anche in matrici complesse.
Valutazione delle analisi HPLC mediante cromatogrammi
Il cromatogramma è il risultato centrale di un’analisi HPLC. Il tempo è riportato sull’asse x, l’intensità del segnale del rivelatore sull’asse y. Ogni picco rappresenta una singola sostanza.
Il tempo di ritenzione è caratteristico di un determinato analita e descrive il tempo necessario per attraversare la colonna. In combinazione con standard di riferimento, consente l’identificazione delle molecole. Un tempo di ritenzione uguale a quello dello standard indica la stessa sostanza. Le molecole possono essere identificate solo in relazione a uno standard.
L’altezza o l’area del picco è proporzionale alla concentrazione della sostanza. Una forma simmetrica del picco è fondamentale per un’analisi accurata. Picchi asimmetrici o sovrapposti possono indicare separazione insufficiente, sovraccarico o problemi della colonna.
Campi di applicazione nell’analisi
L’HPLC è un metodo analitico universalmente applicabile con un’ampia gamma di utilizzi.
Le analisi qualitative servono a identificare i componenti di un campione, ad esempio per il rilevamento di residui di pesticidi negli alimenti, il controllo di autenticità di prodotti naturali come gli oli essenziali o l’identificazione di conservanti nei cosmetici.
Le analisi quantitative determinano il contenuto esatto di una sostanza. Applicazioni tipiche includono la determinazione del contenuto di vitamine ed edulcoranti negli alimenti, la misurazione del principio attivo nei prodotti farmaceutici o l’analisi degli additivi nelle bevande.
L’accoppiamento dell’HPLC con la spettrometria di massa consente inoltre l’identificazione chiara di sostanze sconosciute in matrici complesse.
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